Tarea 3: Tratamiento de muestras

La mayoría de las técnicas de análisis empleadas, tanto clásicas como instrumentales, requieren disponer de la muestra en disolución, y muy pocas son capaces de permitir llevar a cabo el análisis directo en muestras sólidas. Para utilizar estas técnicas se necesita un tratamiento adecuado de la muestra para su empleo correcto. Muchas de las técnicas analíticas comunmente empleadas en el laboratorio son capaces de proporcionar medidas e información de 20 a 60 analitos, la mayoría de ellas requieren disponer previamente de la muestra en una forma medible.

Antes de iniciar una toma de muestra, tenemos que saber qué analito se ha de determinar, en qué concentración, y qué método analítico se ha de seguir.

se añadieron 10mL de solución sulfonítrica y se puso a ebullición por 15 minutos, luego se procedió a filtrar con papel filtro Wattman Nº4, con el fin de eliminar los cuerpos lipídicos.

• Procesado de la muestra bruta (antes del laboratorio)

En general, consta de estas 3 etapas:
- Reducción del tamaño de partícula (trituración)
- Homogeneización
- Reducción del tamaño de muestra

En cuanto al procesado de la muestra bruta normalmente no es necesario porque las muestras recogidas no son de un tamaño demasiado grande para ser transportadas al laboratorio. Sin embargo, también se puede homogenizar la muestra incluyendo el pescado entero ( es decir, la muestra completa: cabeza, piel, órganos internos, músculos y huesos); y una vez que el tejido se homogenizó se pueden preparar ya las alícuotas de la muestra para ser distribuídas a los diferentes laboratorios. En moluscos bivalvos, crustáceos y peces pequeños, cuando éstos se
consuman normalmente enteros, deberán incluirse las vísceras en el
material que vaya a utilizarse para el análisis.

• Preparación de la muestra de laboratorio
  

- Reducción del tamaño de partícula (trituaración/pulverización) y homogenización

Cuando se quieren preparar muestras sólidas en base seca, los sedimentos de cada muestra se pasan a una cápsula de porcelana para su secado 60-100 ºC, durante un periodo de 24 horas; para obtener una muestra representativa de cada una a través de la técnica de cuarteo, las cuales son molidas en mortero de porcelana.


- Tamizado

En esta fase se separan las partículas de la muestra según sus diferentes tamaños para clasificarlo y separarlo.
El tamizado se puede realizar a 200 mallas.
- Secado

Las muestras de la fase de secado pueden no ser aplicadas a todas las situaciones, ya que solo es necesario en los casos en que la concentración de mercurio final es necesaria como un valor de peso seco, p.e. e mg/kg de peso seco. Si las mediciones de peso seco se necesitan, se secan en una estufa a 80ºC hasta que alcance un peso constante.



- Pesada

Se utiliza una balanza de precisión.
Si separamos las distintas partes del pez, los residuos o restos del pescado (cabeza, esqueleto, escamas, etc) se pulverizaron en licuadora previo secado.

- Disolución/disgregación

La disolución es el tratamiento de la muestra sólida en un disolvente adecuada, a temperatura ambiente o en caliente, mediante el cual se consigue la desaparición completa de la fase sólida.
En este caso consiste básicamente en poner la muestra en disolución por el ataque prolongado a baja temperatura 60-100 ºC, con ácidos fuertes (concentrados).


- Destrucción de la materia orgánica

Una opción es que la digestión se haga por un sistema de digestión asistida por microondas.

La muestra se puede digerir en ácido nítrico, lo que ya se hizo en la disolución, de tal modo que se evita el desprendimiento del mercurio.Si tenemos 5 gramos para la digestión se añaden 15 ml de HNO3 y 5 ml de H2 SO 4, se calienta en plato caliente 60- 100 ºC, durante un periodo de 4 horas, se enfría y se filtra, sé afora a 100 ml en balón con agua bidestilada, se agita y se pasa posteriormente a un frasco de polietileno de 100 ml para su conservación y análisis por el espectrofotómetro.

Se puede hacer digestión húmeda para el análisis de mercurio en peces por el procedimiento AOAC, en un medio fuertemente oxidante (sistema cerrado con extractor de gases), a temperatura controlada.
Se aplica el método de óxido-reducción, previa digestión de blancos, patrones y muestras con ácido sulfúrico, ácido nítrico, permanganato de potasio y persulfato de potasio, en baño de agua, a 80ºC, por dos horas si se hace la determicación de mercurio por vapor frío, con cloruro de hidroxilamina y reductor cloruro de estaño.

Para riñón e hígado hay que eliminar tanto tejido conectivo y adiposo como sea posible.

La mineralización consiste en tomar una cantidad suficiente de muestra y quitar toda la grasa y tejido conectivo posible.Picar con cuchillo y luego homogeneizar. Pesar al mg alrededor de 4 g de homogenato en un balón de 125 ml. Agregar 10 ml de mezcla sulfonítrica concentrada y conectar un refrigerante. Luego calentar cautelosamente sobre plancha calefactora, cuidando que la reacción no sea violenta. Refluir 45 minutos. Enfriar el balón y agregar por el extremo superior del refrigerante 10 ml de agua destilada. Refluir otros 30 minutos, para expulsar los óxidos de nitrógeno. Enfriar nuevamente, lavar el interior del refrigerante con 5 ml de agua destilada. Transferir a matraz aforado de 50 mL y llevar a volmen en el mismo.


- Separación

Después de la digestión en microondas se dejan enfriar las muestras, y depués se centrifuga 5 minutos. El sobrenadante se recoge y se le hace la cromatografía.

• Ejemplos de métodos de preparación de muestra

Determinación de mercurio en pescado por espectroscopía por vapor frío:
Una variedad de muestras de conservas de atún fueron adquiridos junto con el material de referencia DORM-2, proporcionada por el CNI de Canadá.
Cada una de las muestras de atún escurrido fueron secadas en toallas de papel. Para cada muestra se hicieron 2 alícuotas de aproximadamente 0,25 gramos, y fueron transferidas a tubos de ensayo de polipropileno 50ml. Para cada alícuota de 5mL, en proporción 3:1 se añadió H2SO4:HNO3. Se secó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las muestras se calentaron a 80ºC durante 40 minutos. En este punto todas las muestras se licuaron. Se añadieron 15mL de HCl 6N, 3mL de disolución de BrCl 0,1N y 4mL de agua desionizada.
Después de la mezcla, las muestras se calentaron a 60ºC durante 60min. La solución de la muestra fue de color amarillo claro, sin precipitado.
Antes del análisis, cada muestra se diluyó proporción 1:10, con HCl 2% y 0,1mL de clorhidrato de hidroxilamina, que se añade para eliminar el bromo libre.


Otro tipo de tratamiento:
Cada pescado se seccionó en tres partes, a saber:
a. Músculo o filete
Se eliminó del tejido la mayor cantidad de grasa posible. Luego se
homogenizó completamente en licuadora y se colocó en bolsas plásticas
selladas.
b. Residuos o restos del pescado (cabeza, esqueleto, escamas, etc).
Las muestras se pulverizaron en licuadora previo secado y se colocaron
en bolsas plásticas selladas para su conservación.
c.Vísceras.
Se eliminó la mayor cantidad de grasa y tejido conectivo posible. Se
homogenizó completamente.

Se tomó el peso para cada una de las partes y, a la vez, se rotularon
debidamente para su posterior análisis.
Se prepararon 25 muestras de cada especie (50 muestras). Cada muestra fue
distribuida en tres secciones (filete, residuos, vísceras) haciendo un total de 150
submuestras.
Todas las submuestras fueron colocadas en un congelador hasta el momento de
su análisis.


Para finalizar, adjuntam0s un link en el que aparece legislación empleada para la preparación de la muestra cuando se quiere determinar el mercurio en peces o moluscos:

Real Decreto 256/2003, de 28 de febrero, por el que se fijan los métodos de toma de
muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de plomo, cadmio,
mercurio y 3-monocloropropano-1,2-diol en los productos alimenticios.
http://www.ucex.org/Legislacion/RD_2562003.pdf