A) Interferencias: se eliminan para así mejorar la selectividad.
B) Analito no detectado por el instrumento analítico: se hace una preconcentración.
Así pues, se puede definir separación como la transferencia de una o más sustancias de una fase inicial a otra.
- Cromatografía
Es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluído que arrastra la muestra a través de una fase estacionaria. Los componentes atraviesan dicha fase a distintas velocidades y se van a separando; luego pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y el tipo de compuesto.
Podemos clasificar las distintas técnicas cromatográficas en:
- Cromatografía plana: la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
- en papel
- en capa fina
- Cromatografía de columna: la fase estacionaria se sitúa dentro de una columna:
- de líquidos
- de gases
- de fluídos supercríticos
La respuesta del detector en función del tiempo se recoge en una gráfica denominada cromatograma. En él el eje horizontal corresponde al volumen o al tiempo equivalente. Normalmente se mantiene constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo) para que el tiempo pueda ser siempre representado en el eje horizontal. El eje vertical es proporcional a la respuesta que se produce en el detector a medida que el líquido efluente del soporte cromatográfico pasa a través de él.
La separación de los componentes depende del ancho de los picos y del espacio de tiempo entre los picos. El parámetro que cuantifica la preferencia por las bandas estrechas es la eficacia cromatográfica.
- Cromatografía líquida
En ella la fase móvil es un líquido.
Fue empleada en este trabajo de investigación por ejemplo:
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2592315)
Dentro de la cromatografía líquida la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), es una de las técnicas más usadas por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria.
Con el objetivo de aumentar la eficacia en las separaciones, el tamaño de las partículas de
fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil.
Por ello se ideó la técnica de la HPLC , que requiere el instrumental especial que permita
trabajar con las altas presiones requeridas.
El HPLC es un sistema de separación de compuestos de metilmercurio muy utilizado cuando se asocia al sistema de detección denominado espectrómetro de masas acoplado a una fuente de plasma inducido por radiofrecuencia. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatográfica.
Es una técnica rápida, cuyas fase móvil y fase estacionaria son de polaridad opuesta, todos los solutos deben ser solubles en la fase móvil, el soluto que entra en la columna debe salir todo de ella y debe haber migración diferencial de los compuestos en la columna.
- Cromatografía de gases
La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de las otras técnicas cromatográficas, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito, su función es transportar. Existen 2 tipos:
- gas- sólido:la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos se produce por adsorción
- gas-líquido:la fase estacionario son moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.
Es la técnica cromatográfica más usada de cuantas se aplican a especiación de mercurio. Inicialmente se usaban columnas de longitud y diámetro interno variable o columnas de vidrio silanizado, pero tenían una serie de problemas, como:
- aparición de colas en los picos cromatográficos
- pobre eficiencia de la columna, lo que conlleva interferencias
- tamaños o áreas de picos reducidos
Con la intención de superar estos inconvenientes se han valorado distintos tipos de columnas capilares durante la última década, utilizando fases polares y apolares. Las columnas con mayor grosor de fase estacionaria y baja polaridad son las más adecuadas ya que dan mayor eficiencia a las separaciones.
Una característica de esta técnica es la necesidad de trabajar con analitos volátiles. Otro aspecto importanto es el sistema de detección usado, que en la mayoría de los casos se lleva a cabo mediante emisiones atómicas.
Esta técnica también se suele acoplar a la espectrometría de masas (este es un procedimiento analítico simple que no requiere solvente orgánico para la extracción y está libre de complicaciones cromatográficas), como es el caso de este análisis hecho en la región de la Mojana:www.hruschka.com/hg-net/.../metilmercurio_en_la_mojana.doc
La cromatografía de gases elimina las posibles causas de interferencias en la medida, y provee medidas de gases disueltos para todo tipo de muestras: concentraciones altas, bajas o muestras sucias.
- Electroforesis
En este caso las separaciones de especies diferentes se basan en su comportamiento distinto bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. La electroforesis es un método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrica form más sencilla de realizar una electroforesis consiste en un tubo en forma de “U” donde se introduce un electrolito y la muestra además por supuesto, de los dos electrodos. Al conectar el sistema las macromoléculas comenzarán a migrar por el tubo hacia el polo opuesto y así irán diferenciándose según su carga. Uno de los inconvenientes que presenta esta técnica es la fluidez del medio, de modo que al cortar la corriente nos encontraríamos con la tendencia natural al equilibrio, con lo que no habríamos logrado nada.
- Electroforesis capilar
Es efectivo llevarla a cabo en un capilar, porque la resistencia eléctrica de la disolución es tan alta que la corriente se mantiene baja. En consecuencia, se puede mantener voltajes más altos con un bajo calentamiento de Joule. La técnica tiene un gran poder de resolución. Las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografía de columna. Los gráficos de respuesta en función del tiempo son los electroferogramas.
Usar un capilar fino tiene un inconveniente: el volumen de la muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos y, después de la separación, cada uno de los analitos está en volumenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños la absorción de luz no se usa normalmente para detectar concentraciones por debajo de 1 micrómetro.
Esta técnica no se encuentra en el mismo grado de desarrollo que las descritas anteriormente en lo que a especiación de mercurio se refiere, aunque parece llamada a ser una clara candidata para ello en el futuro cercano.
Se puede utilizar para la eliminación de interferencias.
