jueves, 3 de junio de 2010

Tarea 5: Determinación del analito en la muestra


En esta tarea vamos a hablar de la segunda etapa del proceso analítico, que es la medida y transducción de la señal analítica. Para ello se necesita un desarrollo y optimización de los métodos y un proceso de calibrado, donde se obtiene la relación entre señal y concentración (curva de calibrado, relación normalmente lineal). La calibración implica medir la respuesta para cantidades variables y conocidas del analito; con ello se obtiene la relación entre las señales producidas por el instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración del conjunto de patrones de calibrado.
A continuación, añadimos unas definiciones de sensibilidad, límite de detección y límite de cuantificación, cuyos valores para los distintos métodos analíticos damos en su correspondiente sección.
La sensibilidad es la relación entre la respuesta del instrumento y la magnitud de la cantidad que estamos midiendo.
El límite de detección es la concentración más baja de un analito que el proceso analítico puede detectar de forma fiable. El límite de cuantificación es la mínima cantidad o concentración de analito que se puede cuantificar con precisión y exactitud. En la siguiente gráfica se muestran datos de límites de detección y de cuantificación de distintas sustancias, entre ellas del mercurio: (www.tdr.cesca.es/TESIS_UPC/AVAILABLE/TDX-0712101-075103//05MetalesComponentesSedimentos02.pdf)

Algunos de los métodos más utilizados para determinar la concentración de mercurio en la muestra de marisco o pez son sobre todo los siguientes:

  • Espectrometría de masas (MS)
Es un conjunto de técnicas utilizadas para la medida de la masa de los iones y su abundancia en la fase gaseosa. Para ello primero hay que generar las moléculas en fase gaseosa, después ionizarlas. Esos iones se separarán por masa, y el instrumento analítico detectará el pico del ión.Éste sería un esquema donde se muestran las partes del espectrómetro de masa:

La señal que da es la relación masa-carga. Aquí añadimos un ejemplo de recta de calibrado:

Determination of mercury compounds in fish by
microwave-assisted extraction and liquid
chromatography-vapor generation-inductively coupled
plasma mass spectrometry
(Chwei-Sheng Chiou, Shiuh-Jen Jiang, K. Suresh Kumar Danadurai)

En este trabajo usan la espectroscopía de masas de plasma (ICP-MS) acoplada a la cromatografía (HPLC), técnica de separación de la que ya hablamos en la anterior tarea. La ICP-MS constituye actualmente una de las técnicas más importantes para el análisis elemental debido al bajo límite de detección conseguidos para la mayoría de los elementos, su buena selectividad y razonable precisión y exactitud. Una antorcha de ICP sirve de atomizador e ionizador. El procedimiento es el siguiente:
- se introduce la muestra en disolución mediante un nebulizador convencional o ultrasónico.
- los iones producidos en la antorcha se introducen a través de una interfase de vacío diferencial.
- los espectros son sencillos ya que consisten en una serie sencilla de picos de isótopos de cada elemento presente en la muestra.

Combinando la cromatografía de separación con esta técnica se puede conseguir que ésta sea capaz de distinguir entre distintas formas químicas de elementos. Además, la separación de interferencias de la matriz por la cromatografía aumentará el rango de aplicación de IMP-MS y simplificará los procesos de preparación de muestra.
La técnica de generación de mercurio aumenta la señal de mercurio considerablemente.
De los datos obtenidos por la HPLC podemos hacer esta gráfica:
Parámetros de calibración de las distintas especies de mercurio:

Componentes:
Hg(II): sensibilidad = 1300 ml/s · ng , coeficiente de correlación = 0.9997, límite de detección= 0.06 ng · ml, tiempo de retención= 2622 s, repetibilidad de la altura del pico= 1.8%
Methyl-Hg: sensibilidad= 1530 ml/ s · ng , coeficiente de correlación= 0.9997, límite de detección= 0.05 ng · ml, tiempo de retención= 1791 s, repetibilidad de la altura del pico= 0.7%
Ethyl-Hg: sensibilidad= 780 ml/ s· ng, coeficiente de correlación= 0.9997, límite de detección= 0.09 ng· mL, tiempo de retención= 3712 s, repetibilidad de la altura del pico= 1.7%






NIVEL DE CONTAMINACION POR METILMERCURIO EN LA REGION DE LA MOJANA
METHYLMERCURY CONTAMINATION LEVELS IN "LA MOJANA”
Claudia X. Ramos, Sandra L. Estévez, Eugenio Giraldo.
(Éste es otro ejemplo del uso de la técnica de espectrometría de masas, combinada con cromatografía de gases)



Optimización de parámetros para la determinación
de mercurio total en pescado, usando MW-CV-FI-AAS
Valiente, L.; Iribarren, L.; Piccinna, M.; Romero Ale, E.
Utilizaron un sistema para la determinación de mercurio con inyección en flujo, Perkin Elmer, Modelo FIMS-400. Es un espectrómetro de absorción atómica dedicado a la determinación de mercurio, basado en la técnica de inyección de flujo. El FIMS utiliza un sistema óptico con una lámpara de mercurio de baja presión y un detector sintonizado a una longitud de onda del mercurio. Incorpora una bomba peristática adicional para brindar una mayor flexibilidad.
Tiene límites de detección <0,01>
La epectrometría de absorción implica la medida de la fracción de luz de una longitud de onda dada que pasa a través de una muestra. La muestra (con solución coloreada), no emite luz por sí misma por lo que se debe incluír una fuente de radiación.
Los espectrómetros de absorción atómica están diseñados para determinar unos pocos elementos sin cambiar las fuentes. No hay problemas con interferencia espectral.
Para dibujar la recta de calibrado representaríamos la absorbancia (señal) entre la concentración:

El espectrofotómetro de absorción con llama (FAAS) permite la detección y determinación de metales en cualquier tipo de muestra industrial siempre y cuando pueda ser solubilizada. Los límites de detección en este caso son del orden de la ppm (partes por millón). Los niveled de concentración que se pueden analizar van desde % hasta ppb. Las partes principales de la absorción atómica con llama son la fuente de radiación, el atomizador, el monocromador y el transductor-detector.

Otro tipo de espectrofotómetro de absorción atómica es GFAAS (AA con cámara de grafito), el cual permite trabajar con muestras de volumen muy reducido o directamente sobre muestras orgánicas líquidas. Por su elevada sensibilidad (niveles de ppb), la técnica se aplica en la detección de metales en productos de alta pureza como nuestro caso, en peces.

En relación a estas dos últimas técnicas, el aporte energético más utilizado es la llama, pero en ocasiones necesita mayor sensibilidad. Una forma para llevar los átomos que constituyen la muestra hasta el estado fundamental es suministrar la energía programadamente por medios electrotérmicos, es decir, sustituímos la llama por la cámara de grafito. Con ello, aumenta la proporción de átomos en estado fundamental, y por tanto también aumenta la sensibilidad (con la cámara de grafito se aumenta la sensibilidad unas 1000 veces más que con la de llama).



jueves, 20 de mayo de 2010

TAREA 4: Técnicas de separación


Para la realización de un muestreo de un material heterogéneo, como es nuestro caso, la finalidad es convertirlo en homogéneo; y además, se quiere analizar una sola parte de esa mezcla física por lo que es necesario separar las partes heterogéneas, ya que en el proceso de separación se pueden introducir errores.

Las técnicas de separación tienen una gran importancia ya que ayudan a resolver 2 problemas que se nos pueden presentar:
A) Interferencias: se eliminan para así mejorar la selectividad.
B) Analito no detectado por el instrumento analítico: se hace una preconcentración.

Así pues, se puede definir separación como la transferencia de una o más sustancias de una fase inicial a otra.

  • Cromatografía
Es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluído que arrastra la muestra a través de una fase estacionaria. Los componentes atraviesan dicha fase a distintas velocidades y se van a separando; luego pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y el tipo de compuesto.
Podemos clasificar las distintas técnicas cromatográficas en:
- Cromatografía plana: la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
- en papel
- en capa fina
- Cromatografía de columna: la fase estacionaria se sitúa dentro de una columna:
- de líquidos
- de gases
- de fluídos supercríticos

La respuesta del detector en función del tiempo se recoge en una gráfica denominada cromatograma. En él el eje horizontal corresponde al volumen o al tiempo equivalente. Normalmente se mantiene constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo) para que el tiempo pueda ser siempre representado en el eje horizontal. El eje vertical es proporcional a la respuesta que se produce en el detector a medida que el líquido efluente del soporte cromatográfico pasa a través de él.

La separación de los componentes depende del ancho de los picos y del espacio de tiempo entre los picos. El parámetro que cuantifica la preferencia por las bandas estrechas es la eficacia cromatográfica.

- Cromatografía líquida
En ella la fase móvil es un líquido.
Fue empleada en este trabajo de investigación por ejemplo:
Liquid chromatographic-atomic absorption spectrophotometric method for determination of methyl mercury in seafood: collaborative study.Holak W.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2592315)

Con el objetivo de aumentar la eficacia en las separaciones, el tamaño de las partículas de
fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil.
Por ello se ideó la técnica de la HPLC , que requiere el instrumental especial que permita
trabajar con las altas presiones requeridas.

El HPLC es un sistema de separación de compuestos de metilmercurio muy utilizado cuando se asocia al sistema de detección denominado espectrómetro de masas acoplado a una fuente de plasma inducido por radiofrecuencia. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatográfica.
Es una técnica rápida, cuyas fase móvil y fase estacionaria son de polaridad opuesta, todos los solutos deben ser solubles en la fase móvil, el soluto que entra en la columna debe salir todo de ella y debe haber migración diferencial de los compuestos en la columna.

Dentro de la cromatografía líquida la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), es una de las técnicas más usadas por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria.

- Cromatografía de gases
La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de las otras técnicas cromatográficas, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito, su función es transportar. Existen 2 tipos:
- gas- sólido:la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos se produce por adsorción
- gas-líquido:la fase estacionario son moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.

Es la técnica cromatográfica más usada de cuantas se aplican a especiación de mercurio. Inicialmente se usaban columnas de longitud y diámetro interno variable o columnas de vidrio silanizado, pero tenían una serie de problemas, como:
- aparición de colas en los picos cromatográficos
- pobre eficiencia de la columna, lo que conlleva interferencias
- tamaños o áreas de picos reducidos
Con la intención de superar estos inconvenientes se han valorado distintos tipos de columnas capilares durante la última década, utilizando fases polares y apolares. Las columnas con mayor grosor de fase estacionaria y baja polaridad son las más adecuadas ya que dan mayor eficiencia a las separaciones.
Una característica de esta técnica es la necesidad de trabajar con analitos volátiles. Otro aspecto importanto es el sistema de detección usado, que en la mayoría de los casos se lleva a cabo mediante emisiones atómicas.
Esta técnica también se suele acoplar a la espectrometría de masas (este es un procedimiento analítico simple que no requiere solvente orgánico para la extracción y está libre de complicaciones cromatográficas), como es el caso de este análisis hecho en la región de la Mojana:www.hruschka.com/hg-net/.../metilmercurio_en_la_mojana.doc

La cromatografía de gases elimina las posibles causas de interferencias en la medida, y provee medidas de gases disueltos para todo tipo de muestras: concentraciones altas, bajas o muestras sucias.
  • Electroforesis
En este caso las separaciones de especies diferentes se basan en su comportamiento distinto bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. La electroforesis es un método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrica form más sencilla de realizar una electroforesis consiste en un tubo en forma de “U” donde se introduce un electrolito y la muestra además por supuesto, de los dos electrodos. Al conectar el sistema las macromoléculas comenzarán a migrar por el tubo hacia el polo opuesto y así irán diferenciándose según su carga. Uno de los inconvenientes que presenta esta técnica es la fluidez del medio, de modo que al cortar la corriente nos encontraríamos con la tendencia natural al equilibrio, con lo que no habríamos logrado nada.

- Electroforesis capilar

Es efectivo llevarla a cabo en un capilar, porque la resistencia eléctrica de la disolución es tan alta que la corriente se mantiene baja. En consecuencia, se puede mantener voltajes más altos con un bajo calentamiento de Joule. La técnica tiene un gran poder de resolución. Las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografía de columna. Los gráficos de respuesta en función del tiempo son los electroferogramas.
Usar un capilar fino tiene un inconveniente: el volumen de la muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos y, después de la separación, cada uno de los analitos está en volumenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños la absorción de luz no se usa normalmente para detectar concentraciones por debajo de 1 micrómetro.

Esta técnica no se encuentra en el mismo grado de desarrollo que las descritas anteriormente en lo que a especiación de mercurio se refiere, aunque parece llamada a ser una clara candidata para ello en el futuro cercano.
Se puede utilizar para la eliminación de interferencias.

jueves, 6 de mayo de 2010

Tarea 3: Tratamiento de muestras

La mayoría de las técnicas de análisis empleadas, tanto clásicas como instrumentales, requieren disponer de la muestra en disolución, y muy pocas son capaces de permitir llevar a cabo el análisis directo en muestras sólidas. Para utilizar estas técnicas se necesita un tratamiento adecuado de la muestra para su empleo correcto. Muchas de las técnicas analíticas comunmente empleadas en el laboratorio son capaces de proporcionar medidas e información de 20 a 60 analitos, la mayoría de ellas requieren disponer previamente de la muestra en una forma medible.

Antes de iniciar una toma de muestra, tenemos que saber qué analito se ha de determinar, en qué concentración, y qué método analítico se ha de seguir.

se añadieron 10mL de solución sulfonítrica y se puso a ebullición por 15 minutos, luego se procedió a filtrar con papel filtro Wattman Nº4, con el fin de eliminar los cuerpos lipídicos.


  • Procesado de la muestra bruta (antes del laboratorio)
En general, consta de estas 3 etapas:
- Reducción del tamaño de partícula (trituración)
- Homogeneización
- Reducción del tamaño de muestra

En cuanto al procesado de la muestra bruta normalmente no es necesario porque las muestras recogidas no son de un tamaño demasiado grande para ser transportadas al laboratorio. Sin embargo, también se puede homogenizar la muestra incluyendo el pescado entero ( es decir, la muestra completa: cabeza, piel, órganos internos, músculos y huesos); y una vez que el tejido se homogenizó se pueden preparar ya las alícuotas de la muestra para ser distribuídas a los diferentes laboratorios. En moluscos bivalvos, crustáceos y peces pequeños, cuando éstos se
consuman normalmente enteros, deberán incluirse las vísceras en el
material que vaya a utilizarse para el análisis.

  • Preparación de la muestra de laboratorio

- Reducción del tamaño de partícula (trituaración/pulverización) y homogenización

Cuando se quieren preparar muestras sólidas en base seca, los sedimentos de cada muestra se pasan a una cápsula de porcelana para su secado 60-100 ºC, durante un periodo de 24 horas; para obtener una muestra representativa de cada una a través de la técnica de cuarteo, las cuales son molidas en mortero de porcelana.


- Tamizado

En esta fase se separan las partículas de la muestra según sus diferentes tamaños para clasificarlo y separarlo.
El tamizado se puede realizar a 200 mallas.
- Secado

Las muestras de la fase de secado pueden no ser aplicadas a todas las situaciones, ya que solo es necesario en los casos en que la concentración de mercurio final es necesaria como un valor de peso seco, p.e. e mg/kg de peso seco. Si las mediciones de peso seco se necesitan, se secan en una estufa a 80ºC hasta que alcance un peso constante.



- Pesada

Se utiliza una balanza de precisión.
Si separamos las distintas partes del pez, los residuos o restos del pescado (cabeza, esqueleto, escamas, etc) se pulverizaron en licuadora previo secado.

- Disolución/disgregación

La disolución es el tratamiento de la muestra sólida en un disolvente adecuada, a temperatura ambiente o en caliente, mediante el cual se consigue la desaparición completa de la fase sólida.
En este caso consiste básicamente en poner la muestra en disolución por el ataque prolongado a baja temperatura 60-100 ºC, con ácidos fuertes (concentrados).


- Destrucción de la materia orgánica

Una opción es que la digestión se haga por un sistema de digestión asistida por microondas.

La muestra se puede digerir en ácido nítrico, lo que ya se hizo en la disolución, de tal modo que se evita el desprendimiento del mercurio.Si tenemos 5 gramos para la digestión se añaden 15 ml de HNO3 y 5 ml de H2 SO 4, se calienta en plato caliente 60- 100 ºC, durante un periodo de 4 horas, se enfría y se filtra, sé afora a 100 ml en balón con agua bidestilada, se agita y se pasa posteriormente a un frasco de polietileno de 100 ml para su conservación y análisis por el espectrofotómetro.

Se puede hacer digestión húmeda para el análisis de mercurio en peces por el procedimiento AOAC, en un medio fuertemente oxidante (sistema cerrado con extractor de gases), a temperatura controlada.
Se aplica el método de óxido-reducción, previa digestión de blancos, patrones y muestras con ácido sulfúrico, ácido nítrico, permanganato de potasio y persulfato de potasio, en baño de agua, a 80ºC, por dos horas si se hace la determicación de mercurio por vapor frío, con cloruro de hidroxilamina y reductor cloruro de estaño.

Para riñón e hígado hay que eliminar tanto tejido conectivo y adiposo como sea posible.

La mineralización consiste en tomar una cantidad suficiente de muestra y quitar toda la grasa y tejido conectivo posible.Picar con cuchillo y luego homogeneizar. Pesar al mg alrededor de 4 g de homogenato en un balón de 125 ml. Agregar 10 ml de mezcla sulfonítrica concentrada y conectar un refrigerante. Luego calentar cautelosamente sobre plancha calefactora, cuidando que la reacción no sea violenta. Refluir 45 minutos. Enfriar el balón y agregar por el extremo superior del refrigerante 10 ml de agua destilada. Refluir otros 30 minutos, para expulsar los óxidos de nitrógeno. Enfriar nuevamente, lavar el interior del refrigerante con 5 ml de agua destilada. Transferir a matraz aforado de 50 mL y llevar a volmen en el mismo.


- Separación

Después de la digestión en microondas se dejan enfriar las muestras, y depués se centrifuga 5 minutos. El sobrenadante se recoge y se le hace la cromatografía.


  • Ejemplos de métodos de preparación de muestra
Determinación de mercurio en pescado por espectroscopía por vapor frío:
Una variedad de muestras de conservas de atún fueron adquiridos junto con el material de referencia DORM-2, proporcionada por el CNI de Canadá.
Cada una de las muestras de atún escurrido fueron secadas en toallas de papel. Para cada muestra se hicieron 2 alícuotas de aproximadamente 0,25 gramos, y fueron transferidas a tubos de ensayo de polipropileno 50ml. Para cada alícuota de 5mL, en proporción 3:1 se añadió H2SO4:HNO3. Se secó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las muestras se calentaron a 80ºC durante 40 minutos. En este punto todas las muestras se licuaron. Se añadieron 15mL de HCl 6N, 3mL de disolución de BrCl 0,1N y 4mL de agua desionizada.
Después de la mezcla, las muestras se calentaron a 60ºC durante 60min. La solución de la muestra fue de color amarillo claro, sin precipitado.
Antes del análisis, cada muestra se diluyó proporción 1:10, con HCl 2% y 0,1mL de clorhidrato de hidroxilamina, que se añade para eliminar el bromo libre.


Otro tipo de tratamiento:
Cada pescado se seccionó en tres partes, a saber:
a. Músculo o filete
Se eliminó del tejido la mayor cantidad de grasa posible. Luego se
homogenizó completamente en licuadora y se colocó en bolsas plásticas
selladas.
b. Residuos o restos del pescado (cabeza, esqueleto, escamas, etc).
Las muestras se pulverizaron en licuadora previo secado y se colocaron
en bolsas plásticas selladas para su conservación.
c.Vísceras.
Se eliminó la mayor cantidad de grasa y tejido conectivo posible. Se
homogenizó completamente.

Se tomó el peso para cada una de las partes y, a la vez, se rotularon
debidamente para su posterior análisis.
Se prepararon 25 muestras de cada especie (50 muestras). Cada muestra fue
distribuida en tres secciones (filete, residuos, vísceras) haciendo un total de 150
submuestras.
Todas las submuestras fueron colocadas en un congelador hasta el momento de
su análisis.


Para finalizar, adjuntam0s un link en el que aparece legislación empleada para la preparación de la muestra cuando se quiere determinar el mercurio en peces o moluscos:

Real Decreto 256/2003, de 28 de febrero, por el que se fijan los métodos de toma de
muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de plomo, cadmio,
mercurio y 3-monocloropropano-1,2-diol en los productos alimenticios.
http://www.ucex.org/Legislacion/RD_2562003.pdf

viernes, 16 de abril de 2010

Tarea 2: Exactitud y precisión



Para evaluar la calidad de nuestro análisis debemos tener en cuenta la precisión y la exactitud del método analítico que usemos.

  • Exactitud
La exactitud indica la cercanía de la medida al valor aceptado o verdadero y se expresa mediante el error. Los errores en esta determinación de Hg en peces y mariscos pueden tener graves consecuencia y ocasionar por ejemplo problemas en la salud. La exactitud se expresa en términos del error absoluto o relativo.

Para obtener resultados lo suficientemente exactos van a tener que utilizarse materiales de referencia (con una matriz similar a la que utilizamos) y métodos oficiales de análisis, otras opciones serían preparar una muestra de referencia en el laboratorio que conste de una matriz similar a la utilizada y una cantidad conocida de analito (en este caso de Hg), o realizando ejercicios de intercomparación entre laboratorios.

- Materiales de referencia

Podría utilizarse material de referencia certificado para trazas de metales en músculo de cazón, DORM-2, proveniente del National Research Council of Canada (NRCC); o de este mismo sitio material certificado para materiales traza de hígado de cazón cuyos componentes se muestran a continuación:

Certified Values for DOLT-4
Element Mass Fraction
(mg/kg)
Arsenic (d,e,h) 9.66 ± 0.62
Cadmium (d,e,i,p) 24.3 ± 0.8
Copper (d,e,i,p) 31.2 ± 1.1
Iron (d,i) 1833 ± 75
Lead (d,e,p) 0.16 ± 0.04
Mercury (c,d,p) 2.58 ± 0.22
Nickel (d,e,i,p) 0.97 ± 0.11
Selenium (e,h) 8.3 ± 1.3
Silver (d,e,p) 0.93 ± 0.07
Zinc (d,i,p) 116 ± 6
CH3Hg (as Hg)(g,s,t) 1.33 ± 0.12


- Métodos oficiales de análisis
Entre los métodos para la determinación de la concentración del mercurio total en muestras biológicas, estarían:
-Gravimetría
-Micrometría
-Radiometría
-Análisis por titulaciones (volumetría)
-Clorometría y fluorometría
-Espectrometría de absorción atómica, fluorescencia atómica, espectrometría de emisión atómica
-Espectrografía, inducción por microondas
-Plasma de corriente continua
-Análisis por activación neutrónica, fluorescencia de rayos X
-Microanálisis de la sonda, inducida por protones de emisión de rayos X
-Espectrometría de masas
-Electrometría

Todos ellos explicados en la siguiente página:


Nosotros sólo nos vamos a centrar en algunos métodos oficiales:

Método espectofotométrico de absorción atómica de cromatografía de líquidos de metilmercurio en marisco:
El metilmercurio es aislado de la muestra mezcla de cloroformo. Se extrae en un pequeño volumen de 0.01M solución de tiosulfato de sodio. Una alícuota de esta solución se inyecta en una columna Zorbax SAO y se eluyen con solución de acetato de amonio metanol con mercaptoetanol.El mercurio es detectado por espectrofotometría de absorción atómica sin llama usando la interfaz. La espectroscopía de absorción atómica (AA) es un método instrumental de la Química Analítica que determina una gran variedad de elementos al estado fundamental como analitos, se basa en el siguiente esquema:



29.gif (360×270)


Determinación por cromatografía de gas-líquido de metil-mercurio en el pescado y los mariscos:
El metilmercurio se aísla de acetona, el tejido homogeneizado por adición de ácido clorhídrico y extracción de benceno en cloruro de mercurio de metilo que se forma. El benceno extracto se concentra y se analiza para cloruro de metilo de mercurio por cromatografía de captura de electrones, de gas-líquido, el 5% DEGS-PS tratados con solución de cloruro de mercurio inorgánico. A continuación se muestra un esquema del funcionamiento de la cromatografía de gas-líquida:





-Ejercicios de intercomparación entre laboratorios

Podríamos por ejemplo comparar nuestros resultados con los del Centro de Investigación y Desarrollo en Química y Petroquímica (CEQUIPE), que hizo el siguiente trabajo: Optimización de parámetros para la determinación de mercurio total en pescado, usando MW-CV-FI-AAS .

Para determinar la exactitud de la metodología analítica utilizada se utilizan tests estadísticos de comparación de medias (test t de Student, comparación de la media de dos muestras diferentes, test de pares de valores).

  • Precisión
La precisión es la cercanía de los resultados con otros obtenidos exactamente de la misma manera. Para describir la precisión de un conjunto de datos duplicados se utilizan la desviación estándar, la varianza y el coeficiente de varianza. Estos tres términos nos van a informar sobre cuánto difiere de la media cada resultado, lo que se llama desviación de la media.

Podemos saber qué método es más preciso comparando la desviación estándar de sus resultados, siendo el más preciso aquel con menor desviación estándar.
Para conocer si un método es o no preciso hay que calcular el coeficiente de variación, y será preciso cuando éste sea menor al 5%. También se puede hacer un test de comparación de varianzas, si comparamos nuestro método con uno de los oficiales.

Tomamos como ejemplo el siguiente trabajo: Determinación de los niveles de contaminación por Mercurio en la especie Salmo Gairdnerie Irideus y el cuerpo de agua de la Laguna Suches, adyacente al Lago Titicaca del departamento de La Paz, en el que se cogieron 30 muestras de peces (determinaron el tamaño de la muestra por el método probabilístico y al azar). Utilizaron un método basado en la digestión húmeda (procedimiento AOAC). El procedimiento que utilizaron está explicado en este enlace:

Otra metodología sería la siguiente:

Recolección y tratamiento previo de la muestra
Peces: Una vez capturados, los especímenes deben ser identificados (para su ubicación en la cadena trófica), medidos y pesados. Luego colocados en bolsas plásticas y almacenados en hielo para su transporte al laboratorio. Las submuestras para el análisis deben ser obtenidas empleando cuchillos plásticos a partir del músculo dorsal cortando aproximadamente de 5 a 20 gramos de cada espécimen o extrayendo el hígado (mayor acumulación de metales por su poder destoxificador) o el cerebro, almacenándolas en frascos plásticos a una temperatura de -20°C hasta su análisis. Nosotros haríamos unas 11 réplicas.

Digestión de las muestras: En el proceso de digestión, las muestras son solubilizadas y el mercurio es liberado de la matriz biológica o ambiental. Todas las muestras analizadas deben ser digeridas utilizando una mezcla de ácidos nítrico y sulfúrico por un tiempo de tres horas a temperatura controlada entre 100-110 °C

Análisis de mercurio: El análisis de mercurio total puede realizarse empleando espectroscopía de absorción atómica mediante la técnica de vapor frío.
La técnica de vapor frío aprovecha la facultad del mercurio de emitir vapores monoatómicos a temperatura ambiente.
El método es basado en la conversión rápida de los compuestos oxidados de mercurio (Hg2+) a su forma volátil (Hg0) a través de la reducción con SnCl2 (dicloruro de estanio). El mercurio elemental formado en la mezcla es desplazado por burbujeo con aire o acarreado por un gas inerte y transportado en forma de vapor hasta la celda de absorción del equipo situada en la trayectoria óptica del instrumento. La concentración del metal en la muestra es determinada empleando una curva de calibración.

Características de la medición – Técnica de vapor frío
- Técnica: Absorción atómica sin llama (vapor frío)
- Para análisis de Hg
- A temperatura ambiente puede formar vapor atómico
- Las muestras se tratan con SnCl2 o NaBH4
- El vapor de Hg se arrastra por un gas inerte hasta la célula de medida
- Longitud de onda: 253.7 nm
- Es muy sensible (1 ppb)


A los resultados obtenidos calcularíamos el coeficiente de variación para saber si la precisión es aceptable, en cuyo caso sería, como anteriormente indicamos, menor al 5%.
CV= (Desv. típica / media) x 100



miércoles, 17 de marzo de 2010

Tarea 1




El mercurio es un contaminante persistente en el medio ambiente y muy tóxico en general para los seres humanos. Por este motivo genera gran preocupación en todo el mundo, hasta el punto que en algunos países su uso ha sido completamente prohibido. Es dañino por inhalación, ingestión y contacto. La exposición prolongada o repetida (personas que trabajan con él habitualmente sin tomar precauciones), puede provocar lesiones en riñones, cerebro y sistema nervioso. La ingestión de mercurio en pequeñas cantidades, vasta con enjuagar la boca con agua. En grandes cantidades puede provocar vómitos, diarrea, pérdida del apetito y debilidad muscular, por lo que habrá que buscar atención médica. La ingestión prolongada de alimentos contaminados con mercurio provoca la enfermedad conocida como de Minamata. En algunos casos puede provocar pérdida de la vista.

Dicha enfermedad se denomina así porque la ciudad de Minamata (Japón) fue el centro de un brote de envenenamiento por metilmercurio en la década de los 50. En 1956, el año que se detectó el brote, murieron cuarenta y seis personas. Entre 1953 y 1965 se contabilizaron 111 víctimas y más de 400 casos con problemasneurológicos. Madres que no presentaban ningún síntoma dieron a luz niños gravemente afectados.

En 1968, el gobierno japonés anunció oficialmente que la causa de la enfermedad era la ingestión de pescado y de marisco contaminado de mercurio por los vertidos de la empresa petroquímica Chisso. Se calcula que entre 1932 y 1968, año en que cambió el proceso de síntesis por otro menos contaminante, se vertieron a la bahía 81 toneladas de mercurio. En el año 2001 se habían diagnosticado 2.955 casos de la enfermedad de Minamata.

Desde la intoxicación de la bahía de Minamata (Japón,1953), caracterizada por fuertes disturbios neurológicos, con debilidad muscular progresiva, disminución de funciones cerebrales, parálisis, coma y muerte, está comprobado que la toxicidad alimentaria del mercurio está ligada a las propiedades acumulativas del metilmercurio que desde su origen, al transformarse el Hg inorgánico en orgánico, a partir de bacterias acuáticas, se transfiere progresivamente a los escalones de la cadena trófica, de tal modo que los peces carnívoros pueden llegar a contener hasta 400000 veces la cantidad contenida en el agua que se desenvuelven.


Esta imagen representa a un afectado de la enfermedad:





Existen muchos informes recientes alrededor del mundo indicando que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de agua dulce exceden los valores de salud pública internacionalmente recomendados. Además, ha sido estimado que el 95% del mercurio total en peces puede corresponder a metilmercurio. Esta forma química es mucho más tóxica que el mercurio elemental y las sales inorgánicas. Por otro lado la exposición a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del consumo de peces.

Aquí adjuntamos un vídeo sobre un caso de una mujer que ingirió Hg:

(http://terratv.terra.cl/Especiales/Es-noticia/5722-17208/Pescados-causarian-serios-riesgos-a-la-salud.htm)


2) Propiedades del mercurio:

Como propiedades físicas, el mercurio elemental y los haluros alquilmercuriales son solubles en solventes no polares. El mercurio elemental en forma de vapor es más soluble en plasma, en sangre total y en hemoglobina que en agua destilada, donde es disuelto sólo en forma ligera.
Como propiedades químicas, aparece su alta afinidad para formar enlaces covalentes con el azufre.

Como fuentes de contaminación, el mercurio puede llegar de forma natural o antropogénica al medio marino:

En cuanto al origen natural, el mercurio entra en el ambiente como resultado de la ruptura de minerales de rocas y suelos a través de la exposición al viento y agua. Las emisiones de mercurio procedentes de fuentes naturales incluyen el medio ambiente marino y acuático, así como de la actividad volcánica y geotérmica.

La liberación de Mercurio desde fuentes naturales ha permanecido en el mismo nivel a través de los años. Todavía las concentraciones de Mercurio en el medioambiente están creciendo; esto es debido a la actividad humana.

La mayoría del Mercurio liberado por las actividades humanas es liberado al aire, a través de la quema de productos fósiles, minería, fundiciones y combustión de resíduos sólidos. También destacan las sales de mercurio y los compuestos de fenilmercurio,los cuales por presentar una gran actividad antimicrobiana se utilizan como fungicidas y desinfectantes.

Algunas formas de actividades humanas liberan Mercurio directamente al suelo o al agua, por ejemplo la aplicación de fertilizantes en la agricultura y los vertidos de aguas residuales industriales. Todo el Mercurio que es liberado al ambiente eventualmente terminará en suelos o aguas superficiales. Es un metal extremadamente volátil que puede ser transportado a grandes distancias una vez que se ha emitido a la atmósfera.

Estudios recientes, sugieren que las fuentes antropogénicas contribuyen a la liberación de la mayor parte del mercurio, y que la carga total de mercurio atmosférico se ha multiplicado por un factor entre 2 y 5 desde el comienzo de la era industrial. Aproximadamente un tercio de las emisiones totales del mercurio global actual circulan en un ciclo cerrado entre los océanos y la atmósfera, pero se cree que mucho menos del 50 por ciento de las emisiones oceánicas proceden del mercurio originalmente movilizado por fuentes naturales. La recirculación de mercurio a la superficie de la tierra, especialmente desde los océanos, extiende la influencia y el tiempo de actividad de las emisiones antropogénicas de mercurio.

Cabe señalar que únicamente una pequeña cantidad del mercurio generado es reciclado,

convirtiéndose la mayor parte en un contaminante.

Las centrales térmicas de carbón son la fuente individual más importante de contaminación de mercurio. El análisis ha encontrado que cada año unas 49 toneladas de mercurio se emiten directamente al aire por cientos de centrales térmicas en los Estados Unidos de América, confirmado las más recientes estimaciones gubernamentales de contaminación por mercurio. El estudio también ha hallado que una cantidad similar de mercurio –unas 40 toneladas- se acumula en los residuos de la planta cuando los filtros diseñados para capturar azufre y otros contaminantes atmosféricos retienen una porción del mercurio contenido en los gases emitidos por las chimeneas. Una contaminación adicional, estimada en 10 toneladas, se produce durante el lavado del carbón previo a su consumo en las centrales térmicas.

En los ecosistemas acuáticos el mercurio puede provenir de la precipitación atmosférica y/o de la descarga de aguas residuales, principalmente industriales.

El mercurio, una vez que ingresa a los sistemas acuáticos, puede permanecer en el agua o depositarse en los sedimentos. En la columna de agua además del mercurio elemental, existe el mercurio iónico (que puede formar enlaces con el cloro, el ácido sulfhídrico o los ácidos orgánicos) y el mercurio orgánico, particularmente el metilmercurio, el cual en gran parte proviene de los estratos anaeróbicos.

Las aguas superficiales ácidas pueden contener significantes cantidades de mercurio. Cuando los valores de pH están entre cinco y siete, las concentraciones de mercurio en el agua se incrementarán debido a la movilización del mercurio en el suelo. El mercurio que ha alcanzado las aguas superficiales o suelos los microorganismos pueden convertirlo en metil mercurio, una sustancia que puede ser absorbida rápidamente por la mayoría de los organismos y es conocido que daña al sistema nervioso. Los peces son organismos que absorben gran cantidad de metil mercurio de agua superficial cada día. Como consecuencia, el metilmercurio puede acumularse en peces y en las cadenas alimenticias de las que forman parte.

El metilmercurio es el complejo mercurial orgánico más común. Según el Programa Internacional de Seguridad Química de las Naciones Unidas, el mercurio en forma orgánica, es el metilmercurio, es uno de los seis peores contaminantes del planeta. Virtualmente todo el mercurio que se encuentra en tejidos animales está en forma de metilmercurio.

El metilmercurio se forma cuando el mercurio elemental se libera al ambiente y se transforma a través de los procesos de metilación en complejos orgánicos. Esta transformación está mediada por la interacción con bacterias y otros microorganismos que viven en el suelo, las aguas y los sedimentos.

Se sabe que el metilmercurio se bioacumula y bioconcentra en la cadena alimenticia. Esto es, la concentración de Mercurio aumenta en los organismos en posición más alta en la cadena alimentaria. De este modo, por ejemplo, las concentraciones mercuriales serán progresivamente más elevadas al ir tomando muestras de algas , zooplancton , peces fitófagos, peces depredadores y organismos que comen pescado como patos, garzas o el hombre.

El metilmercurio puede ser incorporado por los organismos acuáticos; en el caso de los peces y moluscos la incorporación se da por medio de las branquias, pero como dichos organismos no tienen mecanismos fisiológicos ni bioquímicos eficientes que les permitan la eliminación del metilmercurio, tienden a concentrarlo en sus tejidos.

Las formas orgánicas del Hg son más toxicas que las sales inorgánicas (como con otros metales). Los moluscos bivalvos toman el Hg del agua filtrada rápidamente. La distribución del Hg en los tejidos varía y en los bivalvos es más elevada en las vísceras, y más baja en los músculos.

Si ponemos el bivalvo en agua no contaminada pierde el Hg. La pérdida de mercurio es más rápida si fue ingerido disuelto en el agua que si fue en la comida.

En los peces pelágicos muchas especies oceánicas contienen 150 µg kg¯¹ de Hg en músculo, pero la cantidad es mucho mayor si el pez esta en agua contaminada. Estos peces son carnívoros, están en el final de la cadena trófica y los altos niveles de Hg son consecuencia de bioacumulación. También son animales por lo general muy activos nadan con la boca abierta y fuerzan la entrada de agua que cruzan sus branquias junto con metales (también Hg) disueltos en el agua. La mayor parte del Hg que esta en forma de metilmercurio, no lo excreta y se incrementa la concentración en sus tejidos por bioacumulación.






3) Propiedades de la muestra:

Las sustancias básicas de las que están compuestos los pescados y los mariscos son agua, proteínas, grasas, vitaminas y minerales, su proporción varía según la especie y el tamaño del ejemplar, además del estado de madurez sexual, de las condiciones del medio donde vivían, y la región del cuerpo que es analizada.
El agua es el compuesto que se encuentra en mayor proporción y ocupa del 64 al 81% del peso del cuerpo, seguido por las proteínas, que son el alimento de mayor valor nutritivo del pescado, existiendo del 17 al 25%; después se encuentran las grasas, cuyo contenido varía considerablemente en relación con la especie, por lo que se ha hecho una clasificación de pescados de tipo graso y de tipo magro.

Los principales minerales que necesita son el calcio, el sodio, el hierro, el fósforo y el magnesio.

Tanto en peces como en mariscos pueden haber otros metales pesados aparte del mercurio, cabiendo la posibilidad de producirse interferencias. Adjuntamos una página web donde se muestran unas tablas en las que se encuentran las concentraciones normales de distintos metales pesados en el berberecho:


http://www.unex.es/toxicologia/Publis%20pdf%20Marcos/Metales%20berberecho.pdf (pág.5)


4) Legislación de concentración de mercurio en peces y moluscos

Una de las normas que encontramos es la DIRECTIVA 91/493/CEE de la union europea donde se expresan las siguientes concentraciones.

Niveles de contaminantes químicos (91/351/CEE).

1.- 1.0 ppm de Hg en producto fresco (especies enlistadas) *

2.- 0.5 ppm de Hg en producto fresco (en otras especies).

*lista de especies:
Mero Bonito Pez espada Rape

Atún Raya Pez vela Merlín

Tiburón Anguila Lucio Esturión

Los niveles máximos para mercurio están definidos en las normas NOM-027, 028, 029 y 030-SSA1-93.

Estos datos tambien furon publicados en el Diario Oficial de la Unión Europea 20.12.2006


5) Concentracion normal o usual del analito en la muestra

En diferentes especies al realizar analisis se encuentran como normales las siguientes concentraciones que varian seguen la especie.
  • atún (principalmente en conserva) 0.24 ppm
  • gambas 0.46 ppm
  • almejas 0.05 ppm
  • cangrejos/langostas 0.25 ppm
  • salmón 0.05 ppm
  • ostras 0.04 ppm
  • trucha 0.42 ppm
  • bass 0.21 ppm
  • siluro 0.15 ppm
  • sardinas 0.06 ppm
  • lucio 0.61 ppm
  • pescadilla 0.05 ppm


6) Problematica analitica

LAS ANALÍTICAS DE NIVELES DE MERCURIO REALIZADAS POR EL DEPARTAMENTO DE SANIDAD EN PECES Y MOLUSCOS DEL EBRO NO PRESENTAN NINGÚN INCREMENTO SIGNIFICATIVO
En relación a la presencia de mercurio en las aguas del río Ebro en la demarcación de Tarragona, el Departamento de Sanidad y Seguridad Social ha hecho un seguimiento de los niveles de mercurio en los productos de pesca. Las analíticas se llevan a cabo en este tipo de alimento dado que son claros indicadores de un posible incremento de la presencia de este metal. El día 10 de enero se recogieron muestras de pescados y moluscos de las zonas litorales con influencia de las aguas del río Ebro: anguila, berberecho, almeja, dorada, lisa, coquina y ostrón. Los resultados obtenidos por el Departamento de Sanidad y Seguridad Social indican que no ha habido ningún incremento significativo en los niveles de mercurio presente normalmente en estos productos. Así, según se desprende de las analíticas realizadas, estos niveles detectados en los pescados están por debajo del límite máximo establecido en la normativa de la Unión Europea fijado en un microgramo por kilo de producto fresco. Una vez evaluados los resultados de los análisis hechos por el Departamento de Sanidad se descarta que la contaminación de las aguas del río Ebro haya afectado a los pescados y moluscos de la zona pesquera del litoral. El Departamento de Sanidad y Seguridad Social repetirá el muestreo realizado el pasado día 10 de enero con el fin de comprobar periódicamente los niveles de mercurio en los alimentos.

Resultado de las analíticas llevadas a cabo entre los días 10 y 15 de enero de 2002

Producto Resultado Límite de ppm permitido

Ostrón (ostra portuguesa) 0,044 ppm 1 ppm

Dorada 0,085 ppm 1 ppm

Almeja 0,062 ppm 1 ppm

Berberecho 0,132 ppm 1 ppm

Anguila 0,242 ppm 1 ppm

Lisa 0,114 ppm 1 ppm

Coquinas 0,659 ppm 1 ppm

Ppm: miligramos por kilo.